Serum YKL-40 levels in patients with multiple sclerosis / Níveis séricos de YKL-40 em pacientes com esclerose múltipla

ABSTRACT Background: Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease affecting the central nervous system. The YKL-40 protein, which is secreted from various cells that contribute to inflammation and infection, plays a role in immune regulation. Objective: This study investigated the serum YKL-40 levels of patients with clinically isolated syndrome (CIS) and MS. Methods: The participants was divided into three groups: 1) patients with CIS (n = 20); 2) patients with relapsing-remitting MS (RRMS; n = 39); and 3) healthy individuals (n = 35). The YKL-40 levels in serum samples obtained from the participants were measured using enzyme-linked immunoassays. Results: The median serum YKL-40 level was 20.2 ng/mL (range 9.8-75.9 ng/mL) in the patients with CIS, 22.7 ng/mL (range 13.4-57.9 ng/mL) in the patients with RRMS and 11.0 ng/mL (range 10.0-17.3 ng/mL) in the control group (p < 0.001). The serum YKL-40 levels in the patients with RRMS were correlated with the patients' expanded disability status scale scores and ages (p < 0.05). No relationships were determined between the serum YKL-40 levels and the other variables (p > 0.05). The serum YKL-40 levels were higher in the CIS group than in the MS group. These findings show that the serum YKL-40 levels were high even at the beginning of the disease. The serum YKL-40 levels were also not involved in the progression to clinically definite MS. Conclusions: The findings from this study suggested that YKL-40 may be a useful marker for the inflammatory process of MS.

RESUMO Contexto: A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica que afeta o sistema nervoso central. A proteína UKL-40, secretada de várias células que participam de processos inflamatórios e infecciosos, desempenha um importante papel na regulação imunológica. Objetivo: Este estudo investigou níveis séricos de YKL-40 em pacientes com Síndrome Clinicamente Isolada (SCI) e EM. Métodos: Os participantes foram divididos em três grupos: 1) pacientes com SCI (n = 20); 2) pacientes com EM recorrente-remitente (EMRR; n = 39); e 3) indivíduos saudáveis (n = 35). Os níveis de YKL-40 em amostras séricas obtidas dos participantes foram medidos usando-se imunoensaios ligados a enzimas. Resultados: O nível sérico médio de YKL-40 foi 20.2 ng/mL (range 9.8-75.9 ng/mL) em pacientes com CIS, 22.7 ng/mL (intervalo entre 13.4-57.9 ng/mL) em pacientes com EMRR e 11.0 ng/mL (intervalo entre 10.0-17.3 ng/mL) no grupo controle (p < 0.001). Os níveis séricos de YKL-40 em pacientes com EMRR estavam correlacionados às pontuações e idades dos pacientes na EDSS (p < 0.05). Não foram determinadas relações entre os níveis séricos de YKL-40 e outras variáveis (p > 0.05). Os níveis séricos de YKL-40 no grupo SCI estavam mais elevados do que no grupo EM. Estes resultados demonstram que os níveis séricos de YKL-40 estavam mais elevados até mesmo no início da doença. Os níveis séricos de YKL-40 também não estavam associados à progressão da EM clinicamente definida. Conclusões: A partir deste estudo, os resultados sugeriram que a proteína YKL-40 pode ser um indicador útil no processo inflamatório da EM.

The potential of plant and fungal proteins in the control of gastrointestinal nematodes from animals / Potencial de proteínas de plantas e fungos no controle de nematoides gastrintestinais de animais

Abstract Gastrointestinal nematode infection is an important cause of high economic losses in livestock production. Nematode control based on a synthetic chemical approach is considered unsustainable due to the increasing incidence of anthelmintic resistance. Control alternatives such as the use of natural products are therefore becoming relevant from an environmental and economic point of view. Proteins are macromolecules with various properties that can be obtained from a wide range of organisms, including plants and fungi. Proteins belonging to different classes have shown great potential for the control of nematodes. The action of proteins can occur at specific stages of the nematode life cycle, depending on the composition of the external layers of the nematode body and the active site of the protein. Advances in biotechnology have resulted in the emergence of numerous protein and peptide therapeutics; however, few have been discussed with a focus on the control of animal nematodes. Here, we discuss the use of exogenous proteins and peptides in the control of gastrointestinal.

Resumo A infecção por nematoides gastrintestinais é uma importante causa de grandes perdas econômicas na pecuária. O controle de nematoides com compostos químicos sintéticos é considerado insustentável devido ao aumento da resistência anti-helmíntica. Alternativas de controle, como o uso de produtos naturais, estão se tornando relevantes do ponto de vista ambiental e econômico. As proteínas são macromoléculas com várias propriedades que podem ser obtidas de uma ampla gama de organismos, incluindo plantas e fungos. Proteínas pertencentes a diferentes classes têm mostrado grande potencial para o controle de nematoides. A ação das proteínas pode ocorrer em estágios específicos do ciclo de vida do nematoide, dependendo da composição das camadas externas do parasito e do sítio ativo da proteína. Avanços na biotecnologia resultaram no surgimento de numerosas terapias de proteínas e peptídeos; no entanto, pouco foi discutido com foco no controle de nematoides parasitos de animais. Na presente revisão foi discutido o uso de proteínas exógenas e peptídeos no controle de nematoides gastrintestinais, os mecanismos sugeridos de ação, e os desafios e perspectivas para o uso dessas biomoléculas como uma classe de anti-helmínticos.

Increased levels of chitotriosidase in a patient with Alagille syndrome: association or coincidence? / Aumento dos níveis de quitotriosidase em um paciente com síndrome de Alagille: associação ou coincidência?

ABSTRACT We describe a case of a patient with Alagille syndrome (AS) presenting an increased level of the enzyme chitotriosidase (ChT), evaluating factors that could justify the relationship between AS and ChT. He was a male patient with cholestatic jaundice, facial dysmorphia and congenital heart disease who presented a brief septicemia. He underwent liver biopsy and analyses for inborn errors of metabolism that respectively showed ductopenia and increased levels of ChT. This increase could be potentially explained by inflammatory and infectious processes, or even by AS itself.

RESUMO Descrevemos o caso de um paciente do sexo masculino com síndrome de Alagille (SA), o qual manifestou aumento do nível da enzima quitotriosidase (ChT). Avaliamos os fatores que pudessem justificar a relação entre AS e ChT. O paciente apresentou icterícia colestática, tinha dismorfias faciais, cardiopatia congênita e manifestou um breve quadro de septicemia. Foi submetido à biópsia de fígado e análises para erros inatos do metabolismo que mostraram, respectivamente, ductopenia e aumento dos níveis de ChT. Esse aumento poderia ser potencialmente explicado por processos infecciosos e inflamatórios, ou mesmo pela própria SA.

Anthelmintic activity of Leucaena leucocephala protein extracts on Haemonchus contortus / Atividade anti-helmíntica de extratos proteicos de Leucaena leucocephala sobre Haemonchus contortus

Abstract The objective of this study was to evaluate the effects of protein extracts obtained from the plant Leucaena leucocephala on the nematode parasite Haemonchus contortus. The seeds, shell and cotyledon of L. leucocephala were separated and their proteins extracted using a sodium phosphate buffer, and named as TE (total seed extract), SE (shell extract) and CE (cotyledon extract). Soluble protein content, protease, protease inhibitory and chitinase activity assays were performed. Exsheathment inhibition of H. contortus larvae were performed at concentrations of 0.6 mg mL–1, and egg hatch assays were conducted at protein concentrations of 0.8, 0.4, 0.2, 0.1 and 0.05 mg mL–1. The effective concentration for 50% hatching inhibition (EC50) was estimated by probit. Different proportions of soluble proteins, protease and chitinase were found in TE and CE. Protease inhibitory activity was detected in all extracts. The EC50 of the CE and TE extracts were 0.48 and 0.33 mg mL–1, respectively. No ovicidal effects on H. contortus were detected in SE extracts, and none of the protein extracts demonstrated larvicidal effects on H. contortus. We therefore conclude that protein extracts of L. leucocephala had a detrimental effect on nematode eggs, which can be correlated with the high protease and chitinase activity of these extracts.

Resumo O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade anti-helmíntica de extratos proteicos de leucena (Leucaena leucocephala) sobre Haemonchus contortus. As sementes, as cascas e os cotilédones foram moídos separadamente e as proteínas extraídas com tampão fosfato de sódio e denominados: TE (extrato total), SE (extrato casca) e CE (extrato cotilédone). O teor de proteínas, atividade proteolítica, inibitória de protease e quitinolítica dos extratos foram verificados, além da ação sobre a eclosão de ovos e desembainhamento larvar de H. contortus. A concentração efetiva para inibição de 50% da eclosão dos ovos (EC50) foi calculada através do probit. Foi demonstrado que TE e CE possuem, em diferentes proporções, proteínas solúveis, protease e quitinase. Atividade inibitória de protease foi encontrada em todos os extratos. A EC50 dos extratos CE e TE foram 0,48 e 0,33 mg de proteína mL–1, respectivamente. O extrato SE não apresentou atividade sobre a eclosão dos ovos. Os extratos proteicos não apresentaram efeito larvicida sobre H. contortus. Conclui-se que a ação de extratos proteicos de L. leucocephala afetam negativamente a eclodibilidade dos ovos, correlacionando-se com a alta atividade de protease e quitinase dos extratos testados.

Production and partial purification of antifungal chitinase from Bacillus cereus VITSD3

The current work was designed to isolate and characterize chitin degrading bacteria. Among the 55 bacterial colonies isolated from 7 different soil samples, 4 isolates were capable of degrading chitinase, among which one strain VITSD3 was found to be potent. Based on the morphological, biochemical and molecular characterization of VITSD3 the isolate was confirmed as Bacillus cereus (Genbank accession number: KC961638), designated as Bacillus cereus VITSD3. The crude enzyme had a total activity of 220 U, precipitated with 44.8 U and 22.5 U for dialysed sample. The hydrolysed product NAG (N-Acetyl Glucosamine) from chitin was analysed by high-pressure liquid chromatography (HPLC).The molecular weight of the chitinase was determined using SDS PAGE and found to be 55 kDa. The partially purified chitinase produced from Bacillus cereus VITSD3 showed antifungal activity against Aspergillus fumigatus (18 mm), Aspergillus niger (6 mm) and Aspergillus flavus (15 mm). Hence the investigation suggests a potential benefit of partially purified chitinase extracted from Bacillus cereus VITSD3 which will serve as an excellent antifungal potential with therapeutic use.

O presente trabalho atual foi delineado para isolar e caracterizar bactérias degradadoras de quitina. Entre as 55 colónias bacterianas isoladas a partir de 7 amostras de solo diferentes, quatro isolados foram capazes de degradar quitinase, entre os quais uma estirpe, VITSD3, mostrou-se potente. Com base na caracterização morfológica, bioquímica e molecular de VIT D3 a soluto foi confirmada como Bacillus cereus (número de acesso Genbank: KC961638), designada como Bacillus cereus VITSD3. A enzima bruta tinha uma actividade total de 220 L, precipitou-se com 44,8 L e 22,5 L de amostra dialisada. O produto hidrolisado NAG (N-acetil-glucosamina) a partir de quitina foi analisado por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) .O peso molecular da quitinase foi determinado, utilizando-se SDS-PAGE e verificou-se ser 55 kDa. A quitinase parcialmente purificada produzida a partir de Bacillus cereus VITSD3 mostrou actividade antifúngica contra Aspergillus fumigatus (18 mm), Aspergillus niger (6 mm) e Aspergillus flavus (15 mm). Por isso, a investigação sugere um potencial benefício de quitinase parcialmente purificada extraída de Bacillus cereus VITSD3 o que poderá servir como um excelente potencial antifúngico para uso terapêutico.

Indução de resistência em arroz contra Bipolaris oryzae Breda de Hann, através da expressão constitutiva de um gene de quitinase / Induction of resistance in rice against Bipolaris oryzae Breda de Hann by constitutive expression of achitinase gene

Este trabalho objetivou a transformação genética da cultivar de arroz BRS Taim, para obtenção de resistência ao fungo Bipolaris oryzae, agente da mancha parda. Para a transformação das plantas foi utilizada a cepa LBA 4404 de Agrobacterium tumefaciens transformada com o plasmídeo pMOG 22 que codifica o gene da quitinase do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae. Mesocótilos de arroz foram imersos por 30 min. em solução bacteriana (OD600 = 0,7), contendo acetoceringona (100 Mm). Após os explantes foram co-cultivados por 72 horas em meio MS sem hormônio. Para seleção dos transformantes foi utilizado meio MS com 5 mg L-1 de BAP e 15 mg L-1 de higromicina, incubados a 25±1°C, fotoperíodo de 16 horas e densidade de fluxo de fótons de 42 µmol m-2 s-1. Foram obtidas 5 plantas transformadas, perfazendo uma média de eficiência de transformação de 1,53 %. A resistência das plantas foi observada somente por um dos isolados. Os resultados permitem concluir que as plantas de arroz transformadas com o gene da quitinase(Chit 1)podem reduzir o desenvolvimento do fungo B. oryzae, porém existe uma diferença na reação entre isolados.

This study aimed at a rice transformation for resistance to Bipolaris oryzae causal organism of Brown Spot, the cultivar BRS Taim and the line LBA 4404 of Agrobacterium tumefaciens transformed with plasmid pMOG 22 that codifies the chitinasegene Metarhizium anisopliae was used. Rice mesocotils immersed for 30 min in bacterial solution of OD600 = 0,7 with acetoceringone (100Mm), were co-cultivated for 72 hours in MS medium free of hormones and with 100Mm of acetoceringone. Mesocotils were then transferred to MS with 5mg L-1 de BAP and15 mg L-1 of higromicin for 45 days at 25°C and 16 ligth hours. The five transformed plants obtained (1,53 transformation rate) were inoculated with two B. oryzae isolates.Resistance was observed only with one of the isolates. The results indicate that rice plants transformed with chitinase gene (Chit 1)can reduce the colonization by some isolates of B. oryzae.

Production, purification and application of extracellular chitinase from Cellulosimicrobium cellulans 191 / Produção, purificação e aplicação da quitinase extracelular de Cellulosimicrobium cellulans 191

This study concerned the production, purification and application of extracellular chitinase from Cellulosimicrobium cellulans strain 191. In shaken flasks the maximum yield of chitinase was 6.9 U/mL after 72 h of cultivation at 25ºC and 200 rpm. In a 5 L fermenter with 1.5 vvm aeration, the highest yield obtained was 4.19 U/mL after 168 h of fermentation at 25ºC and 200 rpm, and using 3 vvm, it was 4.38 U/mL after 144 h of fermentation. The chitinase (61 KDa) was purified about 6.65 times by Sepharose CL 4B 200 gel filtration with a yield of 46.61 percent. The purified enzyme was able to lyse the cell walls of some fungi and to form protoplasts.

O presente estudo visou a produção, purificação e aplicação da quitinase extracelular da linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191. A maior produção de quitinase em frascos agitados foi 6,9 U/mL após 72 h de fermentação a 25ºC e 200 rpm. Em fermentador de 5 L utilizando aeração de 1,5 vvm, a maior atividade da enzima foi 4,19 U/mL após 168 h de fermentação a 25ºC e 200 rpm; e com 3 vvm, foi obtido 4,38 U/mL após 144 h de fermentação. A quitinase (61 KDa) foi purificada cerca de 6,65 vezes em coluna de filtração em gel Sepharose CL 4B 200 com um rendimento de 46,61 por cento. A enzima purificada foi capaz de lisar a parede celular de alguns fungos e formar protoplastos.

Molecular cloning of chitinase 33 (chit33) gene from Trichoderma atroviride / Clonagem molecular do gene quitinase 33 (chit33) em Trichoderma atroviride

In this study Trichoderma atroviride was selected as over producer of chitinase enzyme among 30 different isolates of Trichoderma sp. on the basis of chitinase specific activity. From this isolate the genomic and cDNA clones encoding chit33 have been isolated and sequenced. Comparison of genomic and cDNA sequences for defining gene structure indicates that this gene contains three short introns and also an open reading frame coding for a protein of 321 amino acids. The deduced amino acid sequence includes a 19 aa putative signal peptide. Homology between this sequence and other reported Trichoderma Chit33 proteins are discussed. The coding sequence of chit33 gene was cloned in pEt26b(+) expression vector and expressed in E. coli.

Neste estudo Trichoderma atroviride foi escolhido como superprodutor da enzima quitinase dentre 30 isolados de Trichoderma sp. com base na atividade específica de quitinase. Clones de cDNA e genômico codificando chit33 foram obtidos deste isolado e seqüenciados. A comparação das seqüências genômica e de cDNA para definir a estrutura do gene indicou que este contém três pequenos introns e uma fase aberta de leitura codificando uma proteína de 321 aminoácidos. A seqüência de aminoácidos deduzida inclui um possível peptídio sinal de 19 aminoácidos. Homologia entre esta seqüência e outras proteínas Chit33 descritas de Trichoderma é discutida. A seqüência codificadora do gene chit33 foi clonada no vetor de expressão pET26b(+) e expressa em E. coli.

Isolation and characterization of a chitinase gene from entomopathogenic fungus Verticillium lecanii / Isolamento e caracterização de um gene de quitinase do fungo entomopatogênico Verticillium lecanii

Entomopathogenic fungus Verticillium lecanii is a promising whitefly and aphid control agent. Chitinases secreted by this insect pathogen have considerable importance in the biological control of some insect pests. An endochitinase gene Vlchit1 from the fungus was cloned and overexpressed in Escherichia coli. The Vlchit1 gene not only contains an open reading frame (ORF) which encodes a protein of 423 amino acids (aa), but also is interrupted by three short introns. A homology modelling of Vlchit1 protein showed that the chitinase Vlchit1 has a (α/β)8 TIM barrel structure. Overexpression test and Enzymatic activity assay indicated that the Vlchit1 is a functional enzyme that can hydrolyze the chitin substrate, so the Vlchit1 gene can service as a useful gene source for genetic manipulation leading to strain improvement of entomopathogenic fungi or constructing new transgenic plants with resistance to various fungal and insects pests.

O fungo entomopatogênico Verticillium lecanii é um agente promissor no controle da mosca-branca e do pulgão. As quitinases secretadas por esse patógeno de insetos têm uma grande importância no controle biológico de doenças causadas por insetos. Um gene de endoquitinase Vlchit1 desse fungo foi clonado e expresso em Escherichia coli. O gene Vlchit contém não apenas um ORF que codifica uma proteína de 423 aminoácidos, mas também é interrompido por três pequenos introns. A modelagem de homologia da proteína Vlchit1indicou que a quitinase Vlchit1 tem uma estrutura (α/β) 8 TIM barrel. Testes de expressão e de atividade enzimática indicaram que Vlchit1 é uma enzima funcional que hidroliza quitina, portanto o gene Vlchit pode ser um gene útil para manipulação genética para melhoramento de cepas de fungos entomopatogênicos ou para a construção de novas plantas transgênicas com resistência a várias doenças causadas por fungos e insetos.